几十年前，基因治疗的时代可能已经开始了，但基于平台的代理人近期已经相对较近。2017年，Spark Therapeutics，Inc。获得FDA批准Voretigene Neparvovec-Rzyl（Luxturna™），一种表达人类视网膜颜料上皮65kDa5蛋白（HRPE65）的基因的重组腺病相关病毒血清型2（AAV2）载体，用于治疗患者的双晶型RPE65突变相关视网膜营养不良患者。2019年，Avexis，Inc。收到了FDA批准的onAsmnogene abeparvovec-xioi（zolgensma™），一种基于AAV载体的基因治疗，表明对脊髓肌肉萎缩（SMA）少于2岁的儿科患者的基于AAV载体的基因治疗生存电动机神经元1（SMN1）基因中的双胞胎突变。这些批准为这些下一代治疗策略产生了重大的兴趣和热情。尽管基因治疗的承诺，但与技术所在的重组表达结构有关的重要局限性。在这种背景下，基因编辑的出现似乎大多数有趣，特别是鉴于快速生长组织中的重组基因疗法的理论优势。
此外，基因编辑技术有潜力提供几乎无限的机会，以推进精准医疗，以满足未满足的医疗需求。事实上，“聚集规律间隔短回文重复(CRISPR)”-Cas平台已经成为一个中心舞台故事，以新的方式推进治疗发现的头条新闻。遗传学、细胞和分子生物学和药理学作为现代医学的三大战略支柱，还有什么更好的方式来共同研究和开发基因验证的罕见疾病的治疗方法呢?那么，什么是CRISPR-Cas9技术呢?如果调查一下最近出版的文献，就会发现有很多关于这个工具的参考文献。从最简单的意义上说，CRISPR是一种新技术，它允许人们编辑或删除完整细胞和生物体中的基因组区域。最引人注目的发现是两位科学家，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna收到了诺贝尔奖将在2020年开发这种基因编辑方法。
CRISPR/Cas9技术如何用于基因编辑
一些治疗进展包括在造血干细胞中使用CRISPR-Cas9来治疗镰状细胞病和β地中海贫血等严重血液病。在这种情况下，CRISPR-Cas9以一种新的方式被导入骨髓来源的细胞中离体重新介绍能够产生功能性血红蛋白的方式和编辑细胞（1）。在基因上校正Cep290 mRNA的基于CAS9的方法也显示出在视网膜营养障碍（2）中有效。在这方面，通过扩张途径施用发育的治疗剂，称为编辑-101，其导致功能性Cep290 RNA（3）的恢复。例如，在神经退行性疾病中，如果有关递送CRISPR-CAS9系统的治疗组分的挑战，则无界限基因编辑治疗剂的潜力。使用CRISPR-CAS9的治疗方法的另一个例子是Intellia的NTLA-2001，一个在活的有机体内基因编辑剂由含有信使RNA编码Cas9的脂质纳米颗粒组成，靶向正在研究的Transthyretin（TTR）基因的单一导向RNA用于治疗attr淀粉样蛋白病。在一小期患者系列中，显示NTLA-2001，以减少血清TTR水平，从而为其提供乐观在活的有机体内crispr - cas9介导的基因编辑作为一种潜在的治疗策略(4)。
这些基因编辑疗法的例子产生了四个主要的故事。第一，一种新颖而独特的方法正在实施，用于提供基因编辑疗法。这意味着治疗药物的交付以及需要“生物利用度”。第二，基因编辑疗法的安全性正在被仔细检查，特别是在设想偏离目标的方面。第三，必须仔细考虑理想的目标人群，特别是在可能提供外体基因治疗的环境中。第四，也许是最重要的，是选择正确的剂量。当考虑到小分子以及在某种程度上更简单的生物制剂时，通常存在剂量/反应或暴露/反应关系，这意味着潜在的生理学合理假设。这意味着通常有一个广泛的药效剂量范围。然而，在通过永久改变特定组织的基因组来纠正特定作用过程的基因编辑疗法中，明确需要确保首次选择正确的剂量。
让我们更详细地研究这四个关键领域。
翻译策略
载体的递送在确保在作用部位的治疗有效性的优化方面是一个近端挑战。在传统意义上，当我们想到小分子时，我们会看到中央系统室和作用室的更深组织部位，其中有一个确定的动力学序列药物在作用部位的可用性。这一概念与基因编辑疗法相似；然而，现在的重点是载体传递。
通常被引用的基因编辑组件的交付选项包括病毒载体和脂质纳米颗粒(LNPs)。腺相关病毒载体包括衣壳，衣壳包含遗传物质(用于基因编辑或基因治疗平台)和启动子(用于偶体基因治疗)。在这种情况下，衣壳的选择和优化是关键，因为它决定了治疗的效力，免疫原性，但也决定了对所选组织的特异性(即趋向性)。文献中包含了许多关于所选载体谱的功能的争论，因为它涉及细胞内运输、核进入和脱壳，所有这些都可以影响功能转导的水平。确保矢量在交付和优化的背景下进行设计是一个关键的考虑因素。通常情况下，患者必须进行筛查，以确定是否存在对用于分娩的特定AAV载体的预先免疫。如果使用的血清型有预先存在的抗aav抗体，通常转导不会成功。鉴于紧急治疗免疫，剂量选择是至关重要的，因为重新剂量是不可能的。
脂质纳米颗粒提供了递送核苷酸类材料以支持基因编辑或基因治疗方法的分化选择。LNP临床验证为肝脏的有效和安全的交付方式。与AAV不同，LNP在转染肝细胞时非常有效，没有从头限制免疫力，所以重新给药是可能的。LNPs被设计成可代谢的，限制了非天然脂质和基因编辑货物的暴露，从而最大限度地降低了遗传毒性和免疫原性的风险。目前正在进行大量的发现工作，以使LNPs能够靶向其他组织。
减少非目标活动
基因编辑疗法的脱靶效应涉及到单基因编辑，在这一领域一直存在着相当大的争论。其中一个风险与单个引导RNA (gRNA)编辑非预期位点的可能性有关。这可能导致脱靶突变，这可能涉及基因及其功能的永久性改变。因此，该领域强调需要确保导向rna的最高水平的选择性和特异性。
目标人群
对于外体基因治疗，如果在生命早期使用该结构，则其疗效的持久性值得关注。问题是，如果依赖于生长和分裂细胞中的表达，随着时间的推移，上位体将丢失（上位体不会在分裂细胞中复制，通常在细胞增殖过程中丢失）。另一方面，基因编辑将导致基因组的永久性改变，在细胞分裂时，基因组将传递给子细胞。因此，基因编辑可能更适合需要在分裂组织中终身表达的儿科应用。
剂量选择挑战
与小分子和更简单的生物制剂开发不同，利用基因编辑平台研究的剂量范围相对有限。剂量范围受到载体的安全性和耐受性的限制，其中基因编辑成分在载体中传递，肝脏损伤通常限制脂质纳米粒和腺相关病毒载体的可投与量。在这方面，必须确保在恢复治疗功能的范围内存在足够的翻译。该阈值由治疗者应解决的未满足的医疗需求定义。由于治疗范围一方面取决于转基因生产，另一方面取决于潜在的毒性，因此需要仔细决定在临床试验中测试的剂量选择。此外，由于腺相关病毒载体的施用导致抗衣壳抗体的产生，因此这种治疗方法可能只有“一针到位”。
为了帮助剂量选择腺相关病毒载体，需要了解载体脱落和生物分布性质，这可以通过测量主要兴趣和全血组织中的DNA来实现。对病毒载体生物分布的理解出现了来自重组基因治疗经验。这种方法用于voretigene的批准，其中该测量在眼睛的眼泪中进行，并且来自血清，以及3阶段的患者的全血。指导意义的是要注意这是批准的汇总基础，第1阶段研究包括12名经证实的双等位基因RPE65突变相关视网膜营养不良患者，他们接受了三种剂量的治疗，没有明显的剂量相关性发现。最高剂量（1.5 x 1011载体基因组)，然后选择3期研究。同样,在Zolgensma概要批准基础，在多个时间点研究了载体脱落，数据显示，在输注研究治疗后，载体DNA在唾液、尿液和粪便中脱落。在其第1阶段计划中，研究了两种剂量，与所述疗效有明确的剂量-反应关系。患者队列接受4.3×1013到4.6×1013vg / kg和1.1×1014到1.4×1014vg /公斤。选择的3期剂量为1.1 × 1014vg/kg剂量。
有相当大的空间包括亚博集团官网（MIDD）基因治疗和基因编辑的方法，FDA作者最近的一项综述强调了这些方面（5）。作者指出，MIDD将有助于细胞内转运和转基因清除，这些新疗法对这些方面了解甚少，应该继续成为探索性研究的重点。
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David Gutstein医学博士是Regeneron的副总裁，他对基因疗法有着浓厚的兴趣和专长，也是本博客的客座撰稿人。Gutstein博士的研究包括Regeneron与Intellia在基因编辑方面的合作，重点是NTLA-2001和其他项目。
工具书类
- Frangoul H等人。镰状细胞病和β-地中海贫血的CRISPR-Cas9基因编辑。英国医学杂志，384:252-260（2021）。
- Den Hollander Ai等。CEP290（NPHP6）基因中的突变是Leber先天性生物症的常见原因。是。J. HUM。遗传.79:556–561 (2006).
- Maeder ML等。Leber先天性黑蒙10型患者恢复视力丧失的基因编辑方法的开发。纳特。医学。25, 229–233 (2019).
- Gillmore JD等人。CRISPR-CAS9在体内基因编辑用于Transthyretin淀粉样蛋白症。n Engl J Med。2021年6月26日DOI：10.1056 / NejmoA2107454。在线之前在线。
- Belov A等人，《将模型知情药物开发方法应用于基因治疗的机遇和挑战》。CPT药理学系统。药理学亚博集团官网.10:286–290 (2021).